無(wú)菌室浮游菌測試操作規程

　　1 范圍：本標準規定了醫藥工業(yè)無(wú)菌室和潔凈區中浮游菌的測試條件和測試方法。

　　本標準適用于醫藥工業(yè)無(wú)菌室和潔凈區，無(wú)菌室或局部空氣凈化區域(包括潔凈工作臺)的浮游菌的測試和環(huán)境的驗證。

　　2 引用標準：GB/T 16293?2010

　　藥品生產(chǎn)管理規范(1998修訂)附錄。

　　3 標準

　　4 測試方法

　　4.1 方法提要

　　本標本采用的方法是計數濃度法。即通過(guò)收集懸游在空氣中的生物性粒子于專(zhuān)門(mén)的培養基(選擇能證實(shí)其能夠支持微生物生長(cháng)的培養基)，經(jīng)若干時(shí)間和適宜的生長(cháng)條件下讓其繁殖到可見(jiàn)菌落計數，以判定該潔室的微生物濃度。

　　4.2人員的職責及培訓

　　無(wú)菌室的測試人員應進(jìn)行本的培訓并獲得相應的資格后才能才能履行對無(wú)菌室測試的職責，其中包含涉及的衛生知識和基本的微生物知識。

　　無(wú)菌室的測試人員應選擇與生產(chǎn)操作的空氣潔凈度要求相適應的穿戴方式，外面的衣服不能帶進(jìn)100000級以上的區域。

　　4.3 儀器、輔助設備和培養基

　　選擇合適的浮游菌采樣器，包括采用無(wú)油的抽氣泵，較低的氣流流速和較大的采樣流量，以保證培養基表面的水分布被吹干。

　　本測試需要具備儀器、輔助設備和培養基如下：

　　a) 浮游菌采樣器;

　　b) 培養皿;

　　c) 高壓消毒鍋;

　　d) 培養基;

　　e) 恒溫培養箱;

　　4.4 浮游菌采樣器原理

　　浮游菌采樣器一般采用撞擊法機理，可分為夾縫式采樣器、離心式或針孔式采樣器。夾縫式采樣器由內部風(fēng)機將氣流吸入，通過(guò)采樣器的夾縫式平板，將采集空氣噴射并撞擊到緩慢的平板培養基表面，附著(zhù)的活微生物粒子經(jīng)培養后形成菌落。離心式采樣器由于內部風(fēng)機的高速旋轉，氣流從才樣器的前部進(jìn)入后部流出，在離心力的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時(shí)間撞擊到的固型培養條上，附著(zhù)活的微生物粒子經(jīng)培養后形成菌落。針孔式采樣器是氣流通過(guò)一個(gè)金屬蓋吸入，蓋子上是密集的經(jīng)過(guò)機械加工的特制小孔，通過(guò)風(fēng)機將收集到的細小的空氣直接撞擊到平板培養基表面，附著(zhù)的活物微生物粒子經(jīng)培養成型后形成菌落。

　　4.5 測試要點(diǎn)

　　4.5.1 必須按照儀器的檢定周期，定期對測試儀器作檢定。應使用檢定合格，并且使用有效期內的儀器。

　　4.5.2 測試儀器未進(jìn)入被測區域時(shí)，若必需，則先清洗表面吧，或在相應的無(wú)菌室內準備和存放(用保護罩或其他適當地外罩保護儀器)。

　　4.5.3 在100級無(wú)菌室內用紙時(shí)，上面應蒙上一張透明不沾塵的覆蓋物，在100級的無(wú)菌室內不能用鉛筆的橡皮。

　　4.5.4 使用測試儀器時(shí)應嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作。

　　4.5.4.1 儀器開(kāi)機，預熱到穩定后，方可按說(shuō)明書(shū)的規定對儀器進(jìn)行校正，同時(shí)檢查采樣流量，并根據采樣量設定時(shí)間。

　　4.5.4.2 采樣口必須用使用便于消毒及化學(xué)性能穩定的材料制造。

　　4.5.4.3 采樣管?chē)澜麧B漏，內壁應光滑。

　　4.5.4.4 采樣管的長(cháng)度應根據測點(diǎn)的高度定，盡量減少彎曲。

　　4.6 培養皿

　　4.6.1 一般采用φ90mm×15mm規格的培養皿?？筛鶕x用采樣器選擇合適的培養皿。

　　4.6.2離心式采樣器采用的固型培養條

　　4.7 培養基

　　大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)或沙氏培養基(SDA)或其他用戶(hù)認可并經(jīng)驗證的培養基。

　　4.8 恒溫培養箱

　　必須定期對恒溫培養箱進(jìn)行效驗

　　4.9 測試步驟;

　　4.9.1 測試前儀器、培養皿表面必須嚴格消毒。

　　4.9.1.1 采樣器進(jìn)入被測房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，用于100級無(wú)菌室的采樣器

　　宜預先放在被測房間內。

　　4.9.1.2 用消毒劑擦凈培養皿的外表面。

　　4.9.1.3 采樣前，先用消毒劑消毒采樣器的頂蓋、轉盤(pán)以及罩子的內外面，采樣結束，再用消毒劑輕輕噴射罩子的內壁和轉盤(pán)。

　　4.9.1.4 采樣口及采樣管，使用前必須高溫滅菌。如用消毒劑對采樣管的外壁及內壁進(jìn)行消毒時(shí)，應將管中的殘留液倒掉并晾干。

　　4.9.1.5 采樣者應穿戴與被測潔凈區域相應的工作服，在轉盤(pán)上放入或調換培養皿前，雙手用消毒劑消毒或帶無(wú)菌手套操作。

　　4.9.1.6 采樣儀器經(jīng)消毒后先不放入培養皿，開(kāi)啟浮游菌采樣器，使儀器中的殘余消毒劑蒸發(fā)，時(shí)間不少于5min，并檢查流量并根據采樣量調整設定時(shí)間。

　　4.9.1.7 關(guān)閉浮游采樣器，放入培養皿，蓋上蓋子。

　　4.9.1.8 置采樣口于采樣點(diǎn)后，開(kāi)啟浮游菌采樣器進(jìn)行采樣。

　　4.10 培養

　　4.10.1 全部采樣結束后，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養。

　　4.10.2 采用大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)配制的培養經(jīng)采樣后，在30℃～35℃培養箱中培養，時(shí)間不得少于2d;采用沙氏培養基(SDA)配制的培養皿經(jīng)采樣后，在20℃～25℃培養箱中培養，時(shí)間不少于5d。

　　4.10.3每批培養基應有對照試驗，檢驗培養基本身是否污染?？擅颗x定3只培養皿作對照培養。

　　4.11 菌落計數

　　4.11.1 用肉眼對培養皿上所有的菌落直接計數、標記或在菌落計數器上點(diǎn)計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

　　4.11.2 若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辯時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計數。

　　4.12 注意事項

　　4.12.1 使用前應仔細檢查每個(gè)培養皿質(zhì)量，培養基及培養皿有變質(zhì)、破損或污染的不能用使用的。

　　4.12.2 對培養基、培養條件及其他參數作詳細記錄。

　　4.12.3 由于細菌種類(lèi)繁多，差別甚大，計數時(shí)一般用透射光于培養皿面或真面仔細觀(guān)察，不要有遺漏計培養皿邊緣生長(cháng)的菌落，并須要菌菌落或培養基沉淀的物區別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。

　　5 測試規則

　　5.1 測試條件

　　在測試之前要，要對無(wú)菌室相關(guān)參數進(jìn)行預先測試，這類(lèi)測試將會(huì )測試懸浮粒子的環(huán)境條件，例如：這種預先測試或可包括：

　　a) 溫度和相對濕度的測試。 無(wú)菌室的溫度和相對濕度應與其生產(chǎn)及工藝要求相適

　　應(無(wú)特殊要求時(shí)，溫度控制在18℃～26℃，相對濕度控制在45%～65%之間為宜)。同時(shí)滿(mǎn)

　　足測試儀器的使用范圍;

　　b) 室內送風(fēng)量或風(fēng)速的測試的測試，或壓差的測試;

　　c) 過(guò)濾器的泄漏測試

　　5.1 測試狀態(tài)

　　靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種狀態(tài)均可進(jìn)行測試。

　　靜態(tài)測試時(shí)，室內測試人員不得多于2人

　　浮游菌測試前,被測定無(wú)菌室(區)由用戶(hù)決定是否需要預先消毒.

　　浮游菌測試時(shí)應標明測試時(shí)所采用的狀態(tài)和室內測試人員數。

　　5.3 測試時(shí)間

　　5.3.1 在空態(tài)或靜態(tài)a測試時(shí)，對單向流無(wú)菌室而言，測試宜在凈化空氣調節系統正常運行時(shí)間不少于10min后開(kāi)始。對非單向流無(wú)菌室，測試宜在凈化系統正常運行時(shí)間不少于30min后開(kāi)始。在靜態(tài)b測試時(shí)，對單向流潔凈是(區)，測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現場(chǎng)并經(jīng)過(guò)10min自?xún)艉箝_(kāi)始;;對非單向無(wú)菌室，測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現場(chǎng)并經(jīng)過(guò)20min自?xún)艉箝_(kāi)始。

　　5.3.2 在動(dòng)態(tài)測試時(shí)，則須記錄生產(chǎn)開(kāi)始的時(shí)間以及測試時(shí)間。

　　5.4.浮游菌濃度的計算

　　5.4.1采樣點(diǎn)數量及其布置

　　5.4.1.1 少采樣點(diǎn)數目

　　浮游菌的采樣點(diǎn)位置可參照GB/T16292-2010

　　a)工作區測點(diǎn)位置離地0.8～1.5m左右(略高于工作面)。

　　b)送風(fēng)口測點(diǎn)位置離開(kāi)送風(fēng)面30cm左右。

　　c)可在關(guān)鍵設備或關(guān)鍵工作活動(dòng)范圍處增加測點(diǎn)。

　　5.4.2 小采樣量

　　浮游菌每次小采樣量見(jiàn)表1。

　　表1小采樣量

　　5.4.3 采樣次數

　　每個(gè)采樣點(diǎn)一般采樣一次。

　　5.4.4 采樣注意事項

　　5.4.4.1 對于單向流無(wú)菌室或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝應正對氣流方向;對于非單向流無(wú)菌室，采樣口向上。

　　5.4.4.2 布置采樣點(diǎn)時(shí)，至少應盡量避開(kāi)塵粒較集中的回風(fēng)口。

　　5.4.4.3 采樣時(shí)，測試人員應站在采樣口的下風(fēng)側，并盡量少走動(dòng)。

　　5.4.4.4 采取一切措施防止采樣過(guò)程的污染和其他可能對樣本的污染。

　　5.4.4.5 培養皿在用于檢查時(shí)，為避免培養皿運輸或搬動(dòng)過(guò)程造成的影響，宜同時(shí)進(jìn)行陰性對照試驗，每次或每個(gè)區域取1個(gè)對照皿，與采樣皿同法操作但不得暴露采樣皿，然后與采樣后的培養皿(TSA或SDA)一起放入培養箱內培養，結果應無(wú)菌落生長(cháng)。

　　5.5 記錄

　　測試報告中應包含以下內容

　　a)測試者的名稱(chēng)和地址，測試日期;

　　b) 測試依據

　　c)試無(wú)菌室的平面位置(必要時(shí)標注相鄰區域平面位置);

　　d)有關(guān)測試儀器及其測試方法的描述：包括測試環(huán)境條件，采樣點(diǎn)數目及布置圖，測試次數，采樣流量，或可能存在的測試方法的變更，測試儀器的檢定證書(shū)等;若為動(dòng)態(tài)測試，則還應記錄現場(chǎng)操作人員數量及位置，現場(chǎng)運轉設備和數量和位置;

　　e)結果：包括所有統計計算資料。

　　5.6 結果計算

　　5.6.1 用計數方法得出各個(gè)培養皿的菌落數。

　　5.6.2 每個(gè)測點(diǎn)的浮游菌平均濃度的計算，見(jiàn)式(1)。

　　平均濃度(個(gè)/m3)= 菌落數/ 采樣量??????????????? (1)

　　例1：某測點(diǎn)采樣量為400L，菌落數為1，則：

　　平均濃度=1/0.4=2.5個(gè)/m3

　　例2：某測點(diǎn)采樣量為2m3，菌落數為3，則：

　　平均濃度=3/2=1.5個(gè)/m3

　　5.7 結果評定

　　5.7.1 每個(gè)測點(diǎn)的浮游菌平均濃度必須低于所選定的評定標準中關(guān)于細菌濃度的界限。

　　5.7.2 在靜態(tài)測試時(shí)，若某測點(diǎn)的浮游菌平均濃度過(guò)評定標準，則應重新采樣兩次，兩次測試結果均合格才能判為符合。

　　5.8 日常監控

　　對于浮游菌的監控，宜設定糾偏限度和警戒限度沿單一方向呈平行流線(xiàn)并且與氣流方向垂直的斷面上風(fēng)速的氣流，以保證無(wú)菌室的微生物濃度受到控制。應定期以檢查微生物負荷以及消毒劑的效力，并非作傾向分析。靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的監控都可以采用該方法。

　　對于浮游菌的取樣頻率次，如果出現下列情況應考慮應修改，在評估以下情況，也應確定其他項目的檢測頻次：

　　---------------連續過(guò)糾偏和警戒限度;

　　---------------停工時(shí)間比預計延長(cháng);

　　--------------生產(chǎn)期間，空氣凈化系統進(jìn)行任何重大的維修;

　　--------------常操做記錄放映出傾向性的數據;

　　--------------消毒規程的改變;

　　--------------生物污染等;

　　--------------當生產(chǎn)設備有重大維修或增加設備時(shí);

　　--------------當無(wú)菌室結構區域分布有重大變動(dòng)時(shí)。

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